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原代细胞的复苏步骤

来源:万物生物   发布时间:2020-12-10

细胞一般储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

  细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态,今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

  一、检查

  收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70 °C,隔夜后,移到液氮罐保存)。

  二、冷冻细胞解冻 

     方法一:

1、准备好37度水浴锅,预热至37度;

2、准备好T25培养瓶,加入10ml完全培养基(培养基量必须大于冻存液10倍体积);

3、取出冻存细胞管,用一次性PE手套包裹冻存管(防止管内进水导致污染),迅速放于水浴锅内,于1min内融化完全;

4、取出冻存管,酒精喷洒消毒后擦干,置于超净台内;

5、吸取冻存管内细胞悬液,加入步骤2中准备好的T25培养瓶内,8字缓慢摇匀;

6、培养瓶放于37度CO2恒温培养箱内,静置培养24h,更换新鲜换培养基(注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法)。

     方法二:

1、准备好37度水浴锅,预热至37度;

2、准备好15ml无菌离心管,加入10ml完全培养基(培养基量必须大于冻存液10倍体积);

3、准备好实验用培养板或培养器皿;

4、取出冻存细胞管,用PE手套包裹冻存管(防止管内进水导致污染),迅速放于水浴锅内,于1min内融化完全;

5、取出冻存管,酒精喷洒消毒后擦干,置于超净台内;

6、吸取冻存管内细胞悬液,加入步骤2中准备好的15ml无菌离心管,轻轻吹打混匀;

7、将离心管内细胞悬液,按实验需求接种于实验器皿内(注意接种密度不低于2×104/cm2),放于37度CO2恒温培养箱内,静置培养24h,更换新鲜换培养基(注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法)。  

  三、细胞复苏注意事项

1、整个复苏过程要尽量快,溶解时间太长可能影响复苏效果;

2、已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放,尽快稀释或者离心去除DMSO;

  3、由于“化冰”这一步里冻存管与水温差太大,尤其是液氮里拿出来的冻存管,放到水里可能会造成翻江倒海的既视感,所以可以用镊子夹住冻存管往水里摁,这样即使有炸裂的情况也会有水做缓冲;

  4、取冻存管时要谨防冻伤,尤其是夏天,尽管热也最好穿长袖白大褂;

  5、离心这一步也可以在冻存管里的冰融化后直接进行,也就是直接把冻存管离心,离心后弃去原来的冻存液,然后直接加完全培养基重悬细胞,接着把细胞转到培养皿/瓶里培养。这种方法也许不能将DMSO清除得很干净,但是基本影响不大;

  6、 复苏第二天记得去看看细胞,如果状态还不错的话就说明复苏成功。

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