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BCA蛋白定量检测试剂盒

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货号:
S0921K45
产品规格:
1000
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产品详情 操作说明 注意事项

产品简介

目前最常用的蛋白浓度定量检测方法有两种,即Bradford法和BCA法。BCA法定量检测蛋白的基本原理是基于双缩脲反应,即在碱性条件下,Cu2+被蛋白质还原成Cu+,随后Cu+与BCA(Bicinchonic acid,一种显色剂)发生螯合反应,每两分子BCA螯合一个Cu+,生成紫色的水溶性复合物,该物质在562 nm处有最高吸收值,且颜色深浅与蛋白质浓度一定范围内成正比,因此可用于蛋白质的定量检测,蛋白浓度在50-2000 μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

本方法不受绝大部分样品中化学物质的影响,可以兼容样品中高浓度的去垢剂,包括浓度高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween-20、60、80等。但螯合剂和高浓度还原剂会影响检测结果,需确保样品中无EGTA,EDTA浓度低于10 mM,DTT低于1 mM,β-巯基乙醇低于1 mM。


储存与运输

整套试剂可常温运输;蛋白标准品(BSA)4℃保存,有效期12个月。配制成蛋白标准溶液后需-20℃保存,并在6个月内使用。其余试剂常温保存,有效期12个月。


操作步骤

1. 配制蛋白标准贮备液:取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品(BSA)蛋白标准管中,将25 mg蛋白标准品完全溶解,即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。

2. 配制蛋白标准工作液:取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液,用PBS或生理盐水稀释50倍,得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释,确保稀释准确。

3. 绘制标准曲线(酶标仪法):将蛋白标准工作液分别按0,1,2,4,8,12,16,20 μL加到96孔板中,然后用PBS或生理盐水依次加20,19,18,16,12,8,4,0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0,25,50,100,200,300,400,500 μg/mL的梯度曲线。

4. 准备待测样品:将待测的蛋白样品进行适当稀释(可通过预实验检测,使样品蛋白浓度在标准曲线范围内,确保检测结果可信),按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释

5. 配制BCA显色工作液:将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀,得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存,24 h内使用。每个待测样品需200 μL,建议按需配制,避免浪费。

6. 检测:向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL,充分混匀(可将96孔板放在振荡器上振荡30 s),37℃反应30 min后,以标准曲线0号做参比,在562 nm波长下比色测定,记录各孔吸光度值。(注:也可以在室温反应2 h,或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低,建议置于60℃反应)

7. 计算:以标准曲线中梯度蛋白含量(μg/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度(μg/mL),再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。


注意事项

1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大,吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化,如果不能精确控制显色反应的时间和温度,建议每次测定都需要做标准曲线。

2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时,需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释,不要一次稀释50倍,以免产生较大误差。

3. 为保证蛋白的精确定量,样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液,同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值,建议使用其他的方法测定。

4. 操作时请穿实验服,并佩戴一次性手套。

 

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