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产品详情
操作说明
注意事项
产品信息
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产品名称 |
规格 |
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T7 High Yield Transcription Kit |
50T |
产品简介
本试剂盒是利用T7 RNA Polymerase，以含有T7启动子的线性化质粒DNA、PCR产物或合成的DNA为模板，以NTP为底物，在体外转录合成RNA。本试剂盒优化了RNA体外转录反应体系，可以简单快速获得大量的RNA分子，如果转录时在底物中加入修饰的核苷酸，可以制备生物素或染料标记的RNA。本试剂盒主要用于体外翻译、RNase保护实验、杂交探针标记、RNA剪切等生物实验。在反应体系中1 μg的模板投入量可以产生大于100 μg的RNA，适用于制备长度100-5000 nt的RNA。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，12个月有效。
组成
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Component |
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T7 RNA Transcription Enzyme Mix |
200 μL |
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5×T7 Transcription Reaction Buffer |
250 μL |
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25 mM NTP Mix |
100 μL |
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DNase I |
50 μL |
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Nuclease Free Water |
1 mL |
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Control Template (0.5 μg/μL) |
10 μL |
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说明书 |
1份 |
操作步骤
1. 模板准备：
a. 以T7启动子的质粒为模板：为了得到特定长度的RNA，质粒模板必须完全线性化（需要纯化后作为模板），且线性化的质粒确保双链为平末端或5’突出端（避免出现3’突出端），每个反应建议模板量为1 μg；
b. 以T7启动子的PCR产物或合成的DNA片段为模板：PCR扩增模板时将T7启动子（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）加到非编码链引物的5‘端。PCR产物可以不经纯化直接作为转录模板，但纯化后会产出更多的RNA，每个反应建议模板量为0.5 μg左右。
2. 转录反应：按照表格推荐反应体系在洁净的EP管中加入各种试剂，充分混匀后于37℃反应2 h。（如合成小于300 nt的RNA，建议将反应时间延长至4 h或更长时间）。
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Component |
Volume |
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Template |
0.5-1 μg |
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5×T7 Transcription Reaction Buffer |
4 μL |
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25 mM NTP Mix |
2 μL |
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T7 RNA Transcription Enzyme Mix |
4 μL |
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Nuclease Free Water |
To 20 μL |
3. 反应完毕后向体系中加入1 μL DNase I，37℃反应15 min，消化转录的DNA模板。
4. 转录合成的RNA经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。
5. 转录产物定量、检测：通过紫外吸收法可以测定RNA浓度（游离核苷酸会影响定量的准确性，RNA产物需要纯化）；电泳检测推荐采用1%甲醛琼脂糖变性胶检测，电泳液为1×MOPS Buffer（10×MOPS Buffer：0.4 M MOPS，pH 7.0，0.1 M Sodium Acetate，10 mM EDTA）。凝胶制备方法：称取0.5 g琼脂糖加入36 mL RNase-Free Water中，加热溶化后，加入5 mL 10×MOPS Buffer。待溶液冷却至不烫手时，加入9 mL甲醛溶液（37%），混匀后倒胶。电泳检测时取适量RNA与RNA Loading Buffer混合，70℃孵育10 min后冰浴2 min，全部点样。电泳结束后用EB或SerRed染色观察。
注意事项
1. 人体皮肤表面含有丰富的RNase，实验时请带好实验手套、口罩，实验耗材无菌无酶，防止RNase污染。
2. 如需制备标记RNA，请替换试剂盒中的NTP Mix。
3. 试剂盒中对照模板转录长度为500 nt。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
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