服务热线
400-1016-218
免疫共沉淀（Co-IP）
来源：万物生物 发布时间：2021-11-02
免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。
其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀优点
（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
免疫共沉淀缺点
（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
免疫共沉淀实验流程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白免疫共沉淀酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清。
（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜。
（3）取10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3 000 rpm离心3 min。
（4）将预处理过的10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3 000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1 ml 裂解缓冲液洗3~4次；最后加入15 μl 的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟。
（6）SDS-PAGE， Western blotting或质谱仪分析。
注意的问题：
（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
（3）使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
免疫共沉淀注意的问题
（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
（2） 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。
（3） 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
【一站式整体科研服务，成就更高水平的科研成果】
标书基金实验咨询 表观遗传组学分析
课题实验结题指导 细胞分子功能验证
实验培训文章润色 动物模型裸鼠成瘤
临床检测科研转化 病理染色分子互作