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产品详情
操作说明
注意事项
产品简介
本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用2×预混液。核心组分Taq DNA Polymerase是基于抗体法封闭的热启动DNA聚合酶，能有效抑制低温条件下的非特异性扩增，同时配以针对qPCR优化的反应Buffer，非常适合进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。预混液中添加有蓝色染料，具有加样示踪作用，同时配套提供黄色模板稀释液，当用黄色模板稀释液稀释模板，并将其加入到蓝色反应预混液中，颜色由蓝色变为绿色，能够对配制反应体系过程起到示踪作用，防止漏加或错加。该蓝色与黄色染料的光谱与qPCR染料不重叠，不影响反应结果。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。
组成
|
Component Number |
Component |
G3326-01 |
G3326-05 |
G3326-15 |
|
G3326-1 |
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
1 mL |
5×1 mL |
15×1 mL |
|
G3326-2 |
40×Yellow Template Dilution Buffer |
1 mL |
1 mL |
1 mL |
|
说明书 |
1份 | |||
操作步骤
1. （可选）模板稀释
本试剂盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，即为40倍浓缩的黄色模板稀释液，可用于模板稀释，并通过液体颜色改变准确判断模板是否已经加入到qPCR反应液中。
以20 μL qPCR反应体系为例，根据加入到20 μL qPCR反应液中稀释后的模板量，对应原始模板稀释方法可参考下表（以原始模板稀释至100 μL为例）：
|
稀释后的模板 加入到20 μLqPCR反应液中的体积(μL) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
100 μL模板稀释体系中加入 40×Yellow Template Dilution Buffer的体积(μL) |
50 |
25 |
16.7 |
12.5 |
10 |
8.4 |
7.2 |
6.3 |
|
原始模板加入到 100 μL模板稀释体系中的体积(μL) |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
补加Nuclease-Free Water的体积(μL) |
50-x |
75-x |
83.3-x |
87.5-x |
90-x |
91.6-x |
92.8-x |
93.7-x |
例：若20 μL qPCR反应体系中需加稀释后模板2 μL。以100 μL模板稀释体系为例，当加入原始模板体积x为20 μL时，则需加入25 μL40×Yellow Template Dilution Buffer，再补加Nuclease-Free Water 55 μL至总体积为100 μL，此时稀释后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer即为10×。取2 μL此稀释后的模板加入到20 μL反应体系中，最终40×Yellow Template Dilution Buffer即为1×。总之，需保证在最终的qPCR体系中Yellow Template Dilution Buffer为1×。
注：如模板无需稀释，或不使用G3326-2的模板稀释液，可忽略此步骤。
2. 推荐qPCR反应体系：
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Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
|
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1× |
|
Forward Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Templateb |
Variable |
Variable |
as required |
|
Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
|
a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好扩增效果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
3. PCR反应程序（可根据机型适当调整）：
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A. 两步法 |
B. 三步法 | ||||||||
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阶段 |
步骤 |
循环数 |
温度 |
时间 |
阶段 |
步骤 |
循环数 |
温度 |
时间 |
|
Stage 1 |
预变性 |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 1 |
预变性 |
1 |
95℃ |
30 sec |
|
Stage 2 |
变性 |
40 |
95℃
|
15 sec |
Stage 2 |
变性 |
40 |
95℃ |
15 sec |
|
退火/延伸 |
60℃ |
30 seca |
退火 |
55-65℃ |
10 sec |
||||
|
|
|
|
延伸 |
72℃ |
30 seca |
||||
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Stage 3 |
熔解曲线 |
1 |
仪器默认设置 |
Stage 3 |
熔解曲线 |
1 |
仪器默认设置 |
||
a：若需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；若需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
注意事项
1. 如不需要进行移液追踪，则不使用40×Yellow Template Dilution Buffer进行模板稀释。
2. 试剂使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡。
3. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。
4. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制PCR反应液时应避免强光照射。
5. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头，尽量避免样品间的交叉污染。
6. 避免反复冻融Master Mix，解冻后后尽量在一个月内使用完毕。
适配机型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR;
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;
Roche: LightCycler™ 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena: qTOWER系列;
qTOWER: LineGene系列。
引物设计原则
1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间；
2. 引物长度：18-25 bp；
3. 引物中碱基G＋C含量应在40%-60%之间；
4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳，Tm值控制在58-62℃为佳；
5. 碱基分布的随机性；
6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；
7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3'端的互补重叠；
8. 建议引物的3'末端碱基为G或C；
9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。
常见问题及解决方法
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问题描述 |
可能原因 |
解决办法 |
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反应结束无扩增曲线出现或者Ct值出现过晚 |
模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。 |
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模板降解 |
重新制备模板，重复实验。 |
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体系中存在PCR抑制剂 |
一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。 |
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引物可能降解 |
长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。 |
|
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扩增效率低 |
提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。 |
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扩增产物过长 |
扩增产物长度控制在80-300 bp。 |
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空白对照出现信号 |
反应体系污染 |
首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Master Mix； 反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。 |
|
出现引物二聚体等非特异性扩增 |
一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析； 重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序。 |
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熔解曲线出现多峰 |
引物设计不佳 |
根据引物设计原则重新设计新引物。 |
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引物浓度过高 |
适当降低引物浓度。 |
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cDNA模板存在基因组污染 |
提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物。 |
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实验重复性差 |
加样误差大 |
使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液； 高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差； 放大qPCR反应体积。 |
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模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验。 |
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qPCR仪不同位置的温度偏差 |
定期校准qPCR仪。 |
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扩增曲线不光滑 |
荧光信号太弱，经系统校正后产生 |
确保Master Mix中预混的染料未降解； 更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。 |
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扩增曲线断裂或下滑 |
模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值 |
减小基线终点(Ct值-3)，重新分析数据。 |
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个别孔扩增曲线突然骤降 |
反应管内留有气泡 |
确保Mix完全溶解，请勿涡旋振荡混匀； 加样完成后轻弹离心去除气泡； 延长预变性时间至10 min，以去除气泡。 |
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