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产品详情
操作说明
注意事项
产品信息
|
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
| 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
G3326-00 |
200 μL |
|
G3326-01 |
1 mL |
|
|
G3326-05 |
5×1 mL |
|
|
G3326-15 |
15×1 mL |
产品简介
本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用2×预混液。核心组分Taq DNA Polymerase是基于抗体法封闭的热启动DNA聚合酶，能有效抑制低温条件下的非特异性扩增，同时配以针对qPCR优化的反应Buffer，非常适合进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。预混液中添加有蓝色染料，具有加样示踪作用，同时配套提供黄色模板稀释液，当用黄色模板稀释液稀释模板，并将其加入到蓝色反应预混液中，颜色由蓝色变为绿色，能够对配制反应体系过程起到示踪作用，防止漏加或错加。该蓝色与黄色染料的光谱与qPCR染料不重叠，不影响反应结果。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。
组成
|
Component Number |
Component |
G3326-01 |
G3326-05 |
G3326-15 |
|
G3326-1 |
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
1 mL |
5×1 mL |
15×1 mL |
|
G3326-2 |
40×Yellow Template Dilution Buffer |
1 mL |
1 mL |
1 mL |
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说明书 |
1份 | |||
操作步骤
1. （可选）模板稀释
本试剂盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，即为40倍浓缩的黄色模板稀释液，可用于模板稀释，并通过液体颜色改变准确判断模板是否已经加入到qPCR反应液中。
以20 μL qPCR反应体系为例，根据加入到20 μL qPCR反应液中稀释后的模板量，对应原始模板稀释方法可参考下表（以原始模板稀释至100 μL为例）：
|
稀释后的模板 加入到20 μLqPCR反应液中的体积(μL) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
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100 μL模板稀释体系中加入 40×Yellow Template Dilution Buffer的体积(μL) |
50 |
25 |
16.7 |
12.5 |
10 |
8.4 |
7.2 |
6.3 |
|
原始模板加入到 100 μL模板稀释体系中的体积(μL) |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
补加Nuclease-Free Water的体积(μL) |
50-x |
75-x |
83.3-x |
87.5-x |
90-x |
91.6-x |
92.8-x |
93.7-x |
例：若20 μL qPCR反应体系中需加稀释后模板2 μL。以100 μL模板稀释体系为例，当加入原始模板体积x为20 μL时，则需加入25 μL40×Yellow Template Dilution Buffer，再补加Nuclease-Free Water 55 μL至总体积为100 μL，此时稀释后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer即为10×。取2 μL此稀释后的模板加入到20 μL反应体系中，最终40×Yellow Template Dilution Buffer即为1×。总之，需保证在最终的qPCR体系中Yellow Template Dilution Buffer为1×。
注：如模板无需稀释，或不使用G3326-2的模板稀释液，可忽略此步骤。
2. 推荐qPCR反应体系：
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Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
|
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1× |
|
Forward Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Templateb |
Variable |
Variable |
as required |
|
Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
|
a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好扩增效果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
3. PCR反应程序（可根据机型适当调整）：
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A. 两步法 |
B. 三步法 | ||||||||
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阶段 |
步骤 |
循环数 |
温度 |
时间 |
阶段 |
步骤 |
循环数 |
温度 |
时间 |
|
Stage 1 |
预变性 |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 1 |
预变性 |
1 |
95℃ |
30 sec |
|
Stage 2 |
变性 |
40 |
95℃
|
15 sec |
Stage 2 |
变性 |
40 |
95℃ |
15 sec |
|
退火/延伸 |
60℃ |
30 seca |
退火 |
55-65℃ |
10 sec |
||||
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|
|
|
延伸 |
72℃ |
30 seca |
||||
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Stage 3 |
熔解曲线 |
1 |
仪器默认设置 |
Stage 3 |
熔解曲线 |
1 |
仪器默认设置 |
||
a：若需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；若需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
注意事项
1. 如不需要进行移液追踪，则不使用40×Yellow Template Dilution Buffer进行模板稀释。
2. 试剂使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡。
3. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。
4. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制PCR反应液时应避免强光照射。
5. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头，尽量避免样品间的交叉污染。
6. 避免反复冻融Master Mix，解冻后后尽量在一个月内使用完毕。
适配机型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR;
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;
Roche: LightCycler™ 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena: qTOWER系列;
qTOWER: LineGene系列。
引物设计原则
1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间；
2. 引物长度：18-25 bp；
3. 引物中碱基G＋C含量应在40%-60%之间；
4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳，Tm值控制在58-62℃为佳；
5. 碱基分布的随机性；
6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；
7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3'端的互补重叠；
8. 建议引物的3'末端碱基为G或C；
9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。
常见问题及解决方法
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问题描述 |
可能原因 |
解决办法 |
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反应结束无扩增曲线出现或者Ct值出现过晚 |
模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。 |
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模板降解 |
重新制备模板，重复实验。 |
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体系中存在PCR抑制剂 |
一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。 |
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引物可能降解 |
长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。 |
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扩增效率低 |
提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。 |
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扩增产物过长 |
扩增产物长度控制在80-300 bp。 |
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空白对照出现信号 |
反应体系污染 |
首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Master Mix； 反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。 |
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出现引物二聚体等非特异性扩增 |
一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析； 重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序。 |
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熔解曲线出现多峰 |
引物设计不佳 |
根据引物设计原则重新设计新引物。 |
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引物浓度过高 |
适当降低引物浓度。 |
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cDNA模板存在基因组污染 |
提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物。 |
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实验重复性差 |
加样误差大 |
使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液； 高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差； 放大qPCR反应体积。 |
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模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验。 |
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qPCR仪不同位置的温度偏差 |
定期校准qPCR仪。 |
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扩增曲线不光滑 |
荧光信号太弱，经系统校正后产生 |
确保Master Mix中预混的染料未降解； 更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。 |
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扩增曲线断裂或下滑 |
模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值 |
减小基线终点(Ct值-3)，重新分析数据。 |
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个别孔扩增曲线突然骤降 |
反应管内留有气泡 |
确保Mix完全溶解，请勿涡旋振荡混匀； 加样完成后轻弹离心去除气泡； 延长预变性时间至10 min，以去除气泡。 |
凡合肥万物生物科技有限公司销售的产品均有严格的质量保证。如发现产品存在包装规格疑问，请于收货之日起七日内向我公司总部或当地办事处提出，并请保证该产品，以备本公司进行核对检验。如果发现有质量问题，请于收货后一月内保留产品50%以上的量，以便本公司回收产品进行质检，确认产品质量。如逾期，则视为已经对本公司产品进行验收。 声明：如发生产品索赔事宜，本公司仅在产品价格范围内酌情赔偿，恕不接受超出产品价格范围之赔偿。客户在使用过程中有任何技术问题可以拨打技术售后服务电话我们随时给予解答。
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