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CY3-Tyramide

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货号:
KB210515
产品规格:
50 μL
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产品详情 操作说明 注意事项

产品简介

本产品CY3-Tyramide,为荧光染料CY3标记的酪胺,用于酪胺信号放大技术(TSA,Tyramide signal amplification),以下简称TSA技术。TSA技术主要原理:在过氧化氢H2O2存在时,辣根过氧化物酶HRP可以催化酪胺为一种非常活跃的短寿命中间体,在短时间内,中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物,大量富集成以酶为中心的类似“岛”状的聚集团,因使用荧光染料CY3标记了酪胺,使得抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积,实现信号放大。此外,可以通过多次重复免疫标记,使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。


储存与运输

冰袋(wet ice)运输。

-20℃保存,12个月有效。


操作步骤

以组织切片为例,以下实验步骤中的实验用水均为纯水,涉及到的试剂均需用户自备:

1. 组织切片脱蜡至水;

2. 抗原修复:根据所使用的一抗及样本类型,采用合适方式对组织切片进行抗原修复。1×PBS清洗3次,每次5 min;

3. 用免疫组化笔对组织画圈标记;

4. (可选)向组织滴加组织自发荧光淬灭剂,室温孵育30 min,水洗5 min;

5. 灭活内源性过氧化物酶:向切片上加入3% H2O2覆盖组织,室温避光孵育25 min,阻断内源性过氧化物酶,以减少非特异性背景染色。1×PBS清洗3次,每次5 min;

6. 封闭:切片水分稍微甩干后,滴加3%BSA或血清封闭30 min。如果一抗是山羊来源,用10%驴血清封闭,其他来源则用3%BSA封闭;

7. 孵育一抗:用1×PBS或封闭液将一抗稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的封闭液,滴加稀释好的一抗覆盖组织,切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。1×PBS清洗3次,每次5 min;

8. 孵育HRP标记的二抗:用1×PBS或封闭液将二抗稀释至适当浓度,向组织上滴加二抗,室温孵育50 min。1×PBS清洗3次,每次5 min;

9. 配制含0.03‰ H2O2的Tyramide稀释液:1×TBST 100 mL,加入100 μL 3%H2O2,混匀即可。因H2O2容易分解,本溶液需现配现用。

10. 配制TSA染色工作液:用上一步得到的Tyramide稀释液,将iF555-Tyramide稀释500倍,即每1 mL Tyramide稀释液与2 μL CY3-Tyramide混匀,得到TSA染色工作液。每个样品滴加100 μL染色工作液,室温避光孵育10 min。1×PBS清洗3次,每次5 min;

注:TSA染色工作液建议现配现用,需4℃避光保存,24h内有效

11. 微波处理:组织切片置于盛满抗原修复液(根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液)的修复盒中进行微波加热处理,去除已经结合的一抗二抗。此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。

(注:如需进行双重或多重荧光染色,则按此步骤往下进行。如不需进行双重或多重荧光染色,则跳过此步骤,接步骤12进行)

12. 重复步骤7-11,孵育第二个一抗、二抗,以及TSA标记,并微波处理去除一抗、二抗。

13. 细胞核复染DAPI:切片稍甩干后在组织上滴加DAPI染色液,避光室温孵育10 min。1×PBS清洗3次,每次5 min。

14. (可选)组织自发荧光淬灭:向组织上滴加自发荧光淬灭剂,室温孵育5 min,流水冲洗3 min。

15. 封片及镜检:切片稍甩干后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。选择合适的荧光通道观察并采集图像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。


注意事项

1. 本产品室温融化后使用离心机进行离心,干净吸头吹吸混匀后取用。

2. 与荧光二抗相比,TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低,一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍,以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。

3. 如背景荧光较强,建议增加组织自发荧光淬灭步骤。

4. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500,可根据实验结果调整稀释比例(建议稀释比例范围1:200 - 1:1000)。

5. 如进行多重荧光标记,建议先孵育多抗,后孵育单抗;先孵育低丰度目的蛋白对应的抗体,再孵育高丰度目的蛋白对应的抗体。

6. 操作时请穿实验服,并佩戴一次性手套。

 

本产品仅供科研用途,不用于临床诊断!

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