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产品详情
操作说明
注意事项
产品简介
本产品FITC-Tyramide，为荧光染料FITC标记的酪胺，用于酪胺信号放大技术（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA技术主要原理：在过氧化氢H2O2存在时，辣根过氧化物酶HRP可以催化酪胺为一种非常活跃的短寿命中间体，在短时间内，中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物，大量富集成以酶为中心的类似“岛”状的聚集团，因使用荧光染料FITC标记了酪胺，使得抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。此外，可以通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输。
-20℃保存，6个月有效。
操作步骤
以组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水，涉及到的试剂均需用户自备：
1. 组织切片脱蜡至水；
2. 抗原修复：根据所使用的一抗及样本类型，采用合适方式对组织切片进行抗原修复。1×PBS清洗3次，每次5 min；
3. 用免疫组化笔对组织画圈标记；
4. （可选）向组织滴加组织自发荧光淬灭剂，室温孵育30 min，水洗5 min；
5. 灭活内源性过氧化物酶：向切片上加入3% H2O2覆盖组织，室温避光孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色。1×PBS清洗3次，每次5 min；
6. 封闭：切片水分稍微甩干后，滴加3%BSA或血清封闭30 min。如果一抗是山羊来源，用10%驴血清封闭，其他来源则用3%BSA封闭；
7. 孵育一抗：用1×PBS或封闭液将一抗稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的封闭液，滴加稀释好的一抗覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。1×PBS清洗3次，每次5 min；
8. 孵育HRP标记的二抗：用1×PBS或封闭液将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；
9. 配制含0.03‰ H2O2的Tyramide稀释液：1×TBST 100 mL，加入100 μL 3%H2O2，混匀即可。因H2O2容易分解，本溶液需现配现用。
10. 配制TSA染色工作液：用上一步得到的Tyramide稀释液，将iF555-Tyramide稀释500倍，即每1 mL Tyramide稀释液与2 μL FITC-Tyramide混匀，得到TSA染色工作液。每个样品滴加100 μL染色工作液，室温避光孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；
（注：TSA染色工作液建议现配现用，需4℃避光保存，24h内有效）
11. 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。
（注：如需进行双重或多重荧光染色，则按此步骤往下进行。如不需进行双重或多重荧光染色，则跳过此步骤，接步骤12进行）
12. 重复步骤7-11，孵育第二个一抗、二抗，以及TSA标记，并微波处理去除一抗、二抗。
13. 细胞核复染DAPI：切片稍甩干后在组织上滴加DAPI染色液，避光室温孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min。
14. （可选）组织自发荧光淬灭：向组织上滴加自发荧光淬灭剂，室温孵育5 min，流水冲洗3 min。
15. 封片及镜检：切片稍甩干后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。选择合适的荧光通道观察并采集图像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。
注意事项
1. 本产品室温融化后，使用离心机进行短暂离心，干净吸头吹吸混匀后取用。
2. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。
3. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。
4. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（建议稀释比例范围1:200 - 1:1000）。
5. 如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育低丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育高丰度目的蛋白对应的抗体。
6. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。
本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
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