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SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit (With gDNA Remover)
价格：
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货号：
SJ21585
产品规格：
50 rxns
购买数量：
产品详情
操作说明
注意事项
产品简介
本产品利用改造后的突变体逆转录酶以总RNA或mRNA为模板，高效逆转录合成第一链cDNA，试剂盒中包含合成高质量第一链cDNA所需的全部试剂，并提供两种cDNA合成引物供选择：Random Hexamer Primer和Oligo (dT)18 Primer，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或qPCR反应。SweScript RT I (Reverse Transcriptase)是基于M-MLV Reverse Transcriptase并通过体外进化筛选获得的突变体逆转录酶，SweScript RT I无RNase H活性，避免了第一链cDNA合成反应中DNA/RNA杂交体模板中RNA被降解，从而保证第一链cDNA合成量和长度；与野生型酶相比，SweScript RT I的热稳定性和合成效率大幅提高，可在42-55℃范围内高效合成cDNA，同时也可合成长达10 kb的cDNA。
本试剂盒中同时提供gDNA Remover试剂，可在逆转录步骤前快速去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，提高实验结果的可信度，并可简化qPCR引物设计，无需跨外显子设计引物。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；
-20℃保存，12个月有效期。
组成
|
Component Number |
Component |
G3331-50 |
G3331-100 |
|
G3331-1 |
SweScript RT I Enzyme Mixa |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-2 |
5×Reaction Bufferb |
200 μL |
400 μL |
|
G3331-3 |
Oligo (dT)18 Primer (100 μM) |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-4 |
Random Hexamer Primer (100 μM) |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-5 |
gDNA Remover |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-6 |
10×gDNA Remover Buffer |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-7 |
Nuclease-Free Water |
1 mL |
1 mL |
|
说明书
|
1份
|
1份 |
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a：含有RNase Inhibitor；
b：含有dNTP Mixture和Mg2+。
操作步骤
1. 基因组去除
(1) 将RNA模板，Nuclease-Free Water置于冰上融解备用；
(2) 基因组去除反应(推荐10 μL反应体系)：
|
Component |
Volume |
|
10×gDNA Remover Buffer |
1 μL |
|
gDNA Remover |
1 μL |
|
Total RNA/mRNA |
0.1 ng-5 μg / 10 pg-0.5 μg |
|
Nuclease-Free Water |
Add to 10 μL |
(3) 轻轻混匀并离心；
(4) 37℃孵育2 min后置于冰上备用;
2. 第一链cDNA合成
(1) 逆转录反应体系配制（推荐20 μL反应体系）；
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Component |
Volume |
|
上一步基因组去除反应液
|
10 μL |
|
5×Reaction Buffer |
4 μL |
|
Oligo (dT)18 Primer (100 μM) |
1 μL |
|
or Random Hexamer Primer (100 μM) |
or 1 μL |
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or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
|
SweScript RT I Enzyme Mix |
1 μL |
|
Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
注：针对高GC或复杂模板，可预先混合RNA模板、逆转录引物、无核酸酶水并在65℃保温5 min后，迅速置冰上冷却。然后再加入其他反应组分。
(2) 轻轻混匀并离心；
(3) 逆转录程序设置：
|
Temperature |
Time |
|
25℃a |
5 min |
|
50℃b |
15-30 min |
|
85℃ |
5 s |
a：如选择使用Random Hexamer Primer，25℃孵育5 min后，再进行后续反应；如选择使用Oligo (dT)18 Primer或Gene Specific Primer，可直接进行50℃反应；
b:对于高GC或复杂模板，可将逆转录温度提高至55℃。
注意事项
1. 操作时请佩戴一次性手套，避免RNase污染。
2. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
3. 如模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18 Primer，与真核生物mRNA的3' Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
4. 原核生物RNA逆转录请选用Random Hexamer Primer或Gene Specific Primer。
5. Random Hexamer Primer适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
6. 如逆转录后续为qPCR实验，可将Oligo (dT)18 Primer与Random Hexamer Primer混合使用，可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。
7. 如后续qPCR引物跨外显子设计，基因组去除步骤可省略。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
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