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Annexin V-IF647/PI Cell Apoptosis Detection Kit

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货号:
FKU0180
产品规格:
50T
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产品详情 操作说明 注意事项

产品描述

细胞凋亡是发生在胚胎发育和维持组织稳态过程中的正常生理过程,伴随着许多形态学特征改变,其中细胞膜的丢失是细胞凋亡早期的特征之一。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧,但在细胞凋亡早期,PS会从脂膜的内侧翻转外侧,使其暴露于细胞外侧。Annexin V(膜联蛋白V)是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS具有高度亲和力,会与暴露PS的细胞特异性结合,因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过具有完整细胞膜的正常细胞和早期凋亡细胞,但能透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜并将细胞核染色。

本产品通过将EGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)与Annexin V组成融合蛋白作为检测探针,检测细胞的早期凋亡。同时以PI区分存活的细胞与坏死、晚期凋亡细胞。Annexin V-EGFP和PI结合使用,活细胞呈现阴性染色(Annexin V-/PI-),早期凋亡细胞呈现单荧光阳性(Annexin V+/PI-),而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双荧光阳性(Annexin V+/PI+)。本试剂盒适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。同时由于EGFP与Annexin V是1:1融合,因此本产品还可对凋亡细胞进行定量检测。


储存与运输

冰袋(wet ice)运输;2-8℃避光保存,12个月有效。



操作步骤

1. 悬浮细胞:取细胞悬液,经500 g,4℃离心5 min收集细胞;

贴壁细胞:先收集细胞培养上清液。然后用不含EDTA的胰酶消化后,与细胞培养上清液合并,经500 g,4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以免过度消化引起假阳性。

2. 用预冷的PBS清洗细胞2次,每次500 g、4℃离心5 min收集细胞;

3. 用预冷的1×Binding Buffer轻柔重悬细胞,调整细胞浓度至1~5×106/mL;

4. 取100 μL细胞悬液,加入5 µL Annexin V-EGFP和5 µL PI,轻柔混匀,室温避光8-10 min;

5. 加入400 µL预冷的1×Binding Buffer,轻轻摇匀,1 h内用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。

结果分析

1. 流式细胞仪检测

a. 流式细胞仪检测分析时选择合适的电压并调好光补偿,除实验组外建议设置阴性对照(不加Annexin V-EGFP和PI标记)用于调节电压,单标对照(只加Annexin V-EGFP,以及只加PI的细胞)用于调节补偿;

b. 流式细胞仪检测分析参考实例:

用5 µM Camptothecin诱导Jurkat T淋巴瘤细胞6 h,参照以上实验步骤,用流式细胞仪进行检测,结果如下图所示。


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EGFP最大激发波长为488 nm,最大发射波长为507 nm;PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm,最大发射波长为615 nm。经流式细胞仪相关分析软件绘制双色散点图,EGFP位于横坐标,PI位于纵坐标。在典型实验中,活细胞无荧光,散点位于左下第一象限。处于早期凋亡细胞有较强的绿色荧光,散点位于右下第二象限。晚期凋亡细胞、坏死细胞呈现红色、绿色双重荧光,散点位于右上第三象限。

2. 荧光显微镜检测

在载玻片上加5-10 µL经Annexin V-EGFP和PI双染的细胞悬液,盖上盖玻片,在荧光显微镜下用双色滤光片进行观察,Annexin V-EGFP呈绿色荧光信号,PI呈红色荧光信号。


注意事项

1. 整个实验过程操作应尽量轻柔避免细胞破碎,影响实验结果。

2. 用PBS清洗细胞不可省略,同时也要尽可能的去掉残留的PBS。

3. 使用胰酶消化细胞时,应小心操作,避免人为损伤细胞,并控制消化时间。消化时间过短,细胞需用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的机械损伤;若消化时间过长,细胞膜同样容易受到损伤。影响检测结果。另外不能使用含EDTA的胰酶,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

4. 贴壁细胞经凋亡刺激后,如有部分细胞漂浮,需同时收集细胞培养上清液及贴壁细胞合并染色,会使得结果更加准确。

5. Annexin V-EGFP和PI对光敏感,操作时注意避光。反应结束后应尽快进行检测。

6. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套,避免污染,确保安全。

 

本产品仅供科研用途,不用于临床诊断!

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