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产品详情
操作说明
注意事项
细胞介绍
注：本培养基是不直接添加氟尿嘧啶药物的。
细胞特性
1） 来源：结直肠腺癌
2） 形态：上皮样 贴壁生长
3） 含量：>1x106 细胞数
4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
5） 用途：仅供科研使用。
运输和保存
干冰运输及复苏好存活细胞
（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
细胞接收后的处理
1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。
3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。
一．培养基及培养冻存条件准备：
（1）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
（2）完全培养基的配制：
①准备F12K培养基：优质胎牛血清，10%；双抗，1%；补充F12K基础培养基至所需体积。
②准备F12K含5-Fu完全培养基：优质胎牛血清，10%；双抗，1%；5-Fu：400~1065uM；补充F12K基础培养基至所需体积。
（3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
注意：
① 细胞在传代和刚复苏时较为脆弱，中止液须为不含5-Fu的完全培养基，且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含5-Fu的完全培养基，待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加5-Fu。
②若细胞生长状态较为缓慢时，可适当降低5-Fu的浓度，或使用不含5-Fu的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的5-Fu浓度。
二、细胞培养
（1）细胞复苏
①将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
②准备一支15ml离心管，加入5mL含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；
③戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
④将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；
⑤准备一个T25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4mL完全培养基；
⑥离心完成后弃去上清，用1mL完全培养基重悬细胞后，转入T25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
（2）细胞传代
①当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代；
②在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
③向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；
④向瓶内加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶），浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育3~5min；
⑤孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15mL离心管；
注意：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：
a. 准备一个无菌的15mL离心管，加入2mL含10%FBS的完全培养基；
b.将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
c.向之前消化的培养瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2mL含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
⑥1000rpm离心5min；
⑦准备两个新的T25培养瓶，各加入4mL完全培养基；
⑧离心完成后，弃上清，用2mL完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T25培养瓶，每个培养瓶各1mL；
⑨水平放置培养瓶，震荡混匀后将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。
（3）细胞冻存 （注意：细胞冻存建议每瓶T25冻一支）
①~⑥请参照传代步骤；
⑦离完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8mL冻存管中；
⑧将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
⑨第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。记录冻存管位置以便下次拿取。
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